НИТЕНПИРАМНИ ЮҚОРИ САМАРАЛИ СУЮҚЛИК ХРОМАТОГРАФИЯСИ ВА УЛТРАБИНАФША СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ УСУЛЛАРИ ЁРДАМИДА АНИҚЛАШ ҲАМДА ВАЛИДАТСИЯ ҚИЛИШ

Мазкур тадқиқотнинг асосий мақсади: (а) Agilent Zorbax SB-C18 колонкасида ТФ-ЮССХ-DAD методикасини оптималлаштириш; (б) UБС усулини нитенпирамга мослаштириш; (в) иккала усулни ICH Q2(R1) [13] тавсиялари асосида тўлиқ валидация қилиш – аниқ-тинлик, такрорийлик, линейлик, LOD, LOQ ва мустаҳкамлик кўрсаткичларини аниқлаш; (г) тижорат препарат (Capstar®) намуналарига татбиқ қилиш ва натижаларни қиёсий статистик баҳолаш.

МАТЕРИАЛЛАР ВА УСУЛЛАР. Нитенпирам фармакопея стандарти (соф модда: ≥98.5 %; лот: MKBK2317V) Sigma-Aldrich (Darmstadt, Германия) компаниясидан олинди. Ацетонитрил ва метанол ЮССХ тозалик даражасида (≥99.9%), ортофосфор кислота (≥85%), аммоний формиат ва аммоний ацетат аналитик тоза (≥99.0%) Merck (Германия) маҳсулоти эди. Барча эритмалар Milli-Q сув тизимида (Millipore, Бедфорд, АҚШ; 18.2 МΩ·см, 25 °C) тайёрланди. Тижорат препарат намуналари – Capstar® (11.4 мг нитенпирам/таблетка, Elanco Animal Health, n = 20 упаковка) дорихоналардан олинди.

Хроматографик таҳлил Agilent Technologies 1260 Infinity II тизимида (Санта-Клара, АҚШ) олиб борилди; тизим таркибига квадрат насос (G7111B), автоматик намуна юборгич (G7129A), колонка термостати (G7116A) ва диод линейкали детектор DAD (G7117C) кирарди. Колонка: Agilent Zorbax SB-C18, 150 × 4.6 мм, 5 мкм (силика асосли, C18 қоплама, бош гуруҳ блокланган). Ультрабинафша спектрофотометрик ўлчовлар Shimadzu UV-1800 (Киото, Япония) иккита нур ёли спектрофотометрида 1.000 см кварц кювет ёрдамида амалга оширилди. рН назорати Mettler Toledo Seven Compact рН-метрида (аниқлиги ±0.01 рН бирлик) бажарилди. Тортиш Sartorius Entris II аналитик тарозида (аниқлиги ±0.01 мг) амалга оширилди.

Мобил фаза таркиби, рН, оқим тезлиги ва колонка ҳарорати бир омилли тажрибалар орқали оптималлаштирилди. Синалган мобил фаза вариантлари: (i) ацетонитрил–сув, (ii) метанол–сув, (iii) ацетонитрил–аммоний формиат (рН 3.0–4.5), (iv) ацетонитрил–аммоний ацетат (рН 4.5–6.0). Мобил фаза рН 3.0–4.5 оралиғида сканер шаклида ўрганилди. Оқим тезлиги 0.6–1.4 мл/мин, ацетонитрил улуши 20–40% диапазонида синалди. Устун самарадорлиги (N), симметрия коэффициенти (Tf), ушланиш вақти (tR) ва аниқлик критерийлари асосида оптимал шарт-шароит танланди.

Оптималлаштирилган шарт-шароит: мобил фаза A – 0.010 М аммоний формиат буфер эритмаси (ортофосфор кислота билан рН 3.50 ± 0.02 га тузатилган); мобил фаза B – ацетонитрил; нисбат A:B = 70:30 (v/v), изократик режим; оқим тезлиги 1.0 мл/мин; колонка ҳарорати 30.0 ± 0.5 °C; детектор тўлқин узунлиги 270 нм; инъекция ҳажми 10.0 мкл; таҳлил муддати 12 дақиқа.

Асосий стандарт эритма: нитенпирам стандарти (10.00 ± 0.01 мг) аниқ тортилди, 100 мл ўлчов колбасига ўтказилиб, метанол:сув (50:50, v/v) аралашмасида эритилди ва ҳажм белгисига келтирилди (C₀ = 100.00 мкг/мл). Ишчи стандарт эритмалар C₀ дан кетма-кет суюлтириш йўли билан тайёрланди. Калибрлаш эритмалари: ЮССХ учун 7 нуқта (0.5; 1.0; 5.0; 10.0; 25.0; 40.0; 50.0 мкг/мл), УБС учун 8 нуқта (2.0; 5.0; 10.0; 20.0; 40.0; 60.0; 80.0; 100.0 мкг/мл).

Йигирма таблетка (хандаза: 20) мартада тортилди ва ўртача масса ҳисобланди (ўртача масса = 142.8 ± 1.2 мг/таблетка). Ўртача таблетка массасига эквивалент кукун (нитенпирамнинг назарий миқдори ~11.4 мг га мос) аниқ тортиб олинди, 50 мл ўлчов колбасига ўтказилди, 30 мл метанол:сув (50:50) қўшиб 15 дақиқа ултратовуш ванналарида (40 кГц, 25 °C) эритилди. Совутилгандан кейин ҳажм белгисига келтирилди ва 0.45 мкм PTFE мембрана фильтри (Millipore) орқали фильтрланди. Таҳлил учун мос суюлтириш амалга оширилди.

Валидация ICH Q2(R1) [13] ва Eurachem [14] тавсиялари асосида қуйидаги параметрлар бўйича ўтказилди: (1) тизим мувофиқлиги (system suitability); (2) ўзига хослик (specificity/selectivity); (3) чизиқлилик ва диапазон (linearity & range); (4) аниқлаш чегараси LOD ва миқдорий аниқлаш чегараси LOQ; (5) аниқлик – такрорийлик (precision – repeatability, intra-day) ва аралиқ аниқлик (intermediate precision, inter-day); (6) тўғрилик (accuracy, spike-and-recovery); (7) мустаҳкамлик (robustness, Youden-Steiner дизайни). LOD ва LOQ ICH усулида (S/N ≈ 3 ва S/N ≈ 10) ва стандарт оғиш усулида (LOD = 3.3σ/S; LOQ = 10σ/S) ҳисобланди.

Ҳамма ҳисоблашлар Microsoft Excel 365 ва GraphPad Prism 9.5.1 (GraphPad Software, Сан-Диего, АҚШ) дастурларида бажарилди. Регрессия тенгламалари оддий тўқимали тўрт квадрат (OLS) усулида ҳисобланди. F-тест (ANOVA) ва Student t-тести p < 0.05 аҳамиятлилик даражасида қўлланилди. Мустаҳкамлик учун Youden-Steiner аниқлик индекси (YS-коэффициент) ҳисобланди.

НАТИЖАЛАР. Нитенпирамнинг ультрабинафша ютилиш спектри метанол:сув (50:50, v/v) эритувчисида 200–400 нм диапазонида ёзиб олинди. Спектрда аниқ иккита максимум кузатилди. Иккинчи даражали максимум λ₂ = 312 нм да, асосий максимум эса λmax = 270 нм да аниқланди. Ютилиш коэффициенти (молярли экстинкция): ε(270) = 8 640 ± 115 л·мол⁻¹·см⁻¹; ε(312) = 4 210 ± 88 л·мол⁻¹·см⁻¹ (n = 5). Таҳлил учун λ = 270 нм танланди, чунки бу тўлқин узунлигида молекуланинг максимал ютиши кузатилади ва ёрдамчи моддаларнинг ютилиши минимал даражага тушади.

-диаграмма. Нитенпирамнинг ультрабинафша ютилиш спектри (метанол:сув 50:50, C = 20 мкг/мл)

Изоҳ: Асосий максимум λmax = 270 нм (▌); иккинчи даражали максимум λ₂ = 312 нм. Ютилиш зонаси хроматофор тизимига мансуб – нитро ва пиридин халқасининг π→π* ва n→π* ўтишлари.

Оптималлаштирилган хроматографик шарт-шароитларда тизим мувофиқлиги синови (n = 6 мустақил инъекция, C = 10.0 мкг/мл) ўтказилди. Нитенпирам пики tR = 6.84 ± 0.03 мин да кузатилди. Ҳамма USP тизим мувофиқлиги мезонлари қондирилди.

-жадвал. Хроматографик тизим мувофиқлиги кўрсаткичлари (n = 6, C = 10.0 мкг/мл)

Нитенпирамнинг чизиқлилиги ҳар бир концентрация нуқтасида учта мустақил намунани таҳлил қилиш йўли билан аниқланди. Калибрлаш эгри чизиқлари оддий чизиқли регрессия усулида ясалди (OLS, n = 7 ёки 8 нуқта, ҳар бири уч маротаба). F-тест (ANOVA) ва чизиқлилик-нолинейлик тест натижалари ҳар иккала усулда чизиқлилик тасдиқланди (р < 0.0001).

-жадвал. ЮССХ-DAD ва УБС усулларининг чизиқлилик параметрлари (n = 3 × 7 ёки 3 × 8 ўлчов)

Изоҳ: н/а – нолинейлик статистик жиҳатдан аҳамиятли эмас (p > 0.05), чизиқлилик тасдиқланди.

-диаграмма. ЮССХ-DAD усулининг калибрлаш эгри чизиғи: концентрация – пик юзаси боғлиқлиги

Изоҳ: Ҳар бир устун ўртача пик юзасини (n=3) ифодалайди. Хато чизиқлари (error bars) SD дан кам бўлган сабабли кўринмайди.

Аниқлаш чегараси (LOD) ва миқдорий аниқлаш чегараси (LOQ)

LOD ва LOQ ICH Q2(R1) да тавсия этилган иккита мустақил усул ёрдамида ҳисобланди: (а) сигнал/шовқун нисбати (S/N) усули – 10 та бланк эритма (метанол:сув 50:50) хроматограммаси/спектридаги шовқин ўлчаниб, LOD = S/N≈3 ва LOQ = S/N≈10 га мос концентрация аниқланди; (б) стандарт оғиш (σ/S) усули – LOD = 3.3σ/S, LOQ = 10σ/S формулалари қўлланилди. Иккала усул натижалари яхши мутаносибликни кўрсатди.

-жадвал. LOD ва LOQ кўрсаткичлари ва уларни аниқлаш усуллари

-диаграмма. ЮССХ-DAD ва УБС усулларининг сезгирлик кўрсаткичлари қиёси (LOD ва LOQ, мкг/мл)

Изоҳ: ЮССХ-DAD усули LOD кўрсаткичи бўйича УБС усулидан ~5 баравар юқори сезгирликни таъминлайди.

Аниқлик ва такрорийлик синови «намунага қўшиш» (spike-and-recovery) методида уч хил концентрация даражасида (LOQ × 2; ўртача; юқори концентрация) амалга оширилди. Бир кунлик такрорийлик (intra-day precision): бир куннинг ичида учта дақиқа оралиқда олтита мустақил намуна таҳлили. Кунлараро аралиқ аниқлик (inter-day intermediate precision): уч кетма-кет кун мобайнида, уч хил оператор томонидан ўлчанди.

-жадвал. ЮССХ-DAD усулининг аниқлик ва такрорийлик кўрсаткичлари (n = 6 ҳар бир концентрация учун)

-жадвал. УБС усулининг аниқлик ва такрорийлик кўрсаткичлари (n = 6 ҳар бир концентрация учун)

-диаграмма. ЮССХ-DAD ва УБС усулларида нитенпирам тикланиш кўрсаткичлари қиёси (n=6 ± SD)

Изоҳ: ICH Q2(R1) тикланиш мезони 98.0–102.0%. Иккала усул барча концентрация даражаларида мезонни қондиради. ЮССХ ■; УБС ■.

Мустаҳкамлик Youden-Steiner тажриба дизайни (7 омил, 8 тажриба) ёрдамида баҳоланди. ЮССХ учун текширилган омиллар: мобил фаза рН (3.50 ± 0.20), ацетонитрил улуши (30 ± 2%), оқим тезлиги (1.0 ± 0.1 мл/мин), колонка ҳарорати (30 ± 5 °C), инъекция ҳажми (10 ± 2 мкл), тўлқин узунлиги (270 ± 2 нм) ва колонка партияси (2 хил партия). Натижалар жадвалда берилган.

-жадвал. Мустаҳкамлик синови – Youden-Steiner омиллар таъсири (ЮССХ-DAD, n = 3)

Изоҳ: Барча шарт-шароитлар ўзгартирилганда tR ва пик юзаси фарқи ±2.0% дан кичик, N > 7800 – мустаҳкамлик тасдиқланди.

Тижорат препаратга (Capstar®) татбиқ

Ишлаб чиқилган икки усул Capstar® таблеткалари (деклариланган миқдор: 11.4 мг НП/таблетка) таҳлилига татбиқ қилинди. Таҳлил олтита мустақил таблетка намунасида (n = 6) амалга оширилди. Топилган натижалар деклариланган миқдор билан Student t-тести ва F-тест ёрдамида қиёсланди.

-жадвал. Capstar® таблетка (11.4 мг/таблетка) таркибидаги НП миқдорини аниқлаш натижалари (n = 6)

Изоҳ: Барча p-қийматлар 0.05 дан катта – иккала усул деклариланган миқдор билан статистик жиҳатдан мос натижа беради.

-диаграмма. ЮССХ-DAD ва УБС усулларида Capstar® таблетка намунаси таҳлил натижаларининг деклариланган миқдор (11.4 мг/таб.) билан қиёси

Изоҳ: Деклариланган (■) ва топилган (■ ЮССХ; ■ УБС) миқдорлар t-тест (p>0.05) бўйича мос. Ишонч оралиқлари 11.4 мг ни ўз ичига олади.

Ўзига хослик (Selectivity/Specificity)

Ўзига хослик таблетка ёрдамчи моддалари (лактоза моногидрат, микрокристалл целлюлоза, коллоидли кремний диоксиди, магний стеарат) «бланк» намунасини нитенпирамсиз таҳлил қилиш орқали баҳоланди. ЮССХ хроматограммасида tR = 6.84 мин ва ±0.2 мин оралиқда ёрдамчи моддаларга хос пик кузатилмади (пик уст-уст тушмайди). УБС спектрида 270 нм да бланк намунасининг ютилиши A = 0.003 ± 0.001 – аналит сигналининг < 0.5% – интерференция кузатилмади.

Яхлит валидация натижаларининг умумий хулосаси

-жадвал. ICH Q2(R1) валидация параметрлари умумий жадвали: ЮССХ-DAD ва УБС усуллари

МУҲОКАМА

Мазкур тадқиқотда ишлаб чиқилган ТФ-ЮССХ-DAD усулининг мобил фаза таркибини оптималлаштириш жараёнида пиридиний атомининг кислотали муҳитда протонланиш кинетикаси (pKa_1 ≈ 3.1) ва нитро гуруҳнинг диполь момент ўзгаришлари (μ = 6.2 Д) назарда тутилди. рН 3.50 да нитенпирам молекуласидаги пиридин азотининг ~70% протонланган ҳолатда бўлиши С18 колонкасида силанол гуруҳлари билан ортиқча электростатик таъсирланишни камайтиради. Бу симметрик пик шаклини (Tf = 1.08) ва юқори устун самарадорлигини (N = 8 145) таъминлайди [15].

Ацетонитрил (30%) метанол ёки изопропанолдан маъқуллиги унинг паст қовушқоқлиги (0.37 мПа·с, 25 °C) ва юқори элюирлаш кучи туфайлидир. Метанол қўлланганда pik кенглиги ~22% ортиши (W₁/₂ = 0.48 дақ → 0.58 дақ) кузатилди, бу C18 колонкасидаги метанол–С18 бирикиши туфайли юзага келади. Аммоний формиат тампони (0.010 М) эса рН барқарорлигини ±0.02 бирлик доирасида ушлаб туради ва МС детектор билан мувофиқликни таъминлайди.

LOD = 0.048 мкг/мл натижаси Kotade et al. [8] нинг LOD = 0.12 мкг/мл ва Swamy et al. [9] нинг LOD = 0.08 мкг/мл кўрсаткичларига нисбатан юқорирок сезгирликни кўрсатади. Ушбу яхшиланиш асосан мобил фаза рН ини аниқ оптималлаштириш (3.50 ± 0.02) ва колонка ҳарорати назоратини таъминлаш (30.0 ± 0.5 °C) туфайли юзага келди. Колонка ҳарорат назоратисиз (ambient) ишлатилганда N 12–18% га тушишини тажриба кўрсатди.

УБС усулида ε(270) = 8 640 л·мол⁻¹·см⁻¹ нитенпирамнинг нитроимин хроматофор тизимига мансуб n→π* ва π→π* ўтишларидан келиб чиқади. λmax = 270 нм да бошқа неоникотиноидлар (имидаклоприд: λmax = 269 нм, ε = 8 200; тиаметоксам: λmax = 247 нм, ε = 6 400; клотиянидин: λmax = 256 нм, ε = 7 100) нисбатан яқин ютилишни кўрсатади. Бу УБС усулининг неоникотиноидлар аралашмасидаги селективлиги чекланганлигини кўрсатади ва бир компонентли фармацевтик препаратлар таҳлилида УБС қўллаш янада самарали.

Mустаҳкамлик синовида рН энг аҳамиятли омил эканлиги тасдиқланди (Youden-Steiner омил таъсир баллари: рН – 0.68, ACN улуши – 0.34, оқим тезлиги – 0.28). рН ±0.20 бирлик ўзгариши tR ни ±0.14 мин (2.0% дан кам) ўзгартиради. Шу сабабли таҳлил давомида рН-метр калибрланган ва мобил фаза буфер концентрацияси назорат остида сақланиши тавсия этилади.

Capstar® таблеткасида ЮССХ-DAD (99.36%) ва УБС (99.60%) натижаларининг Welch t-тести (p = 0.64 > 0.05) бўйича ўзаро мос бўлиши иккала методнинг мутаносиблигини исботлайди. British Pharmacopoeia (BP 2024) талабига кўра декларированган миқдорнинг 95.0–105.0% оралиқдаги натижа мақбул ҳисобланади; иккала усул бу мезонни осонлик билан қондирди. УБС усулининг юқорироқ RSD (1.48 vs 0.81%) кузатилиши матрица ёрдамчи моддаларининг паст даражали ютилиш интерференциясидан ёки кювет юзасидаги адсорбциядан келиб чиқиши мумкин.

ХУЛОСА. Ушбу тадқиқотда нитенпирамни аниқлаш учун ТФ-ЮССХ-DAD ва ультрабинафша спектрофотометрия усуллари ишлаб чиқилди ва ICH Q2(R1) тавсиялари асосида тўлиқ валидация қилинди. Асосий хулосалар:

ЮССХ-DAD методи LOD = 0.048 мкг/мл, LOQ = 0.145 мкг/мл, чизиқлилик диапазони 0.5–50.0 мкг/мл (r² = 0.99981), RSD < 2.0% ва тикланиш 98.2–101.8% кўрсаткичлари билан фармакокинетик тадқиқотлар, паст концентрацияли биологик намуналар ва кўп компонентли препаратлар таҳлили учун маъқул.

УБС методи LOD = 0.24 мкг/мл, LOQ = 0.73 мкг/мл, чизиқлилик 2.0–100.0 мкг/мл (r² = 0.99952), RSD < 2.0% кўрсаткичлари билан дозаланган шаклларнинг (таблеткалар) рутин сифат назорати, кам ресурсли лабораториялар ва тезкор скрининг учун иқтисодий жиҳатдан мақбул.

Capstar® (11.4 мг/таблетка) таблеткалари таҳлилида ЮССХ (99.36 ± 0.81%) ва УБС (99.60 ± 1.48%) натижалари деклариланган миқдор билан статистик жиҳатдан мос (Student t-тест, p > 0.05), бу иккала усулнинг реал фармацевтик препаратларда ишончлилигини тасдиқлайди.

Мустаҳкамлик синови (Youden-Steiner) ЮССХ методи учун рН энг аҳамиятли омил эканлигини аниқлади; рН ± 0.20 оралиқда назорат тавсия этилади.

Иккала ишлаб чиқилган методика фармацевтик, ветеринария ва экотоксикологик лабораториялар учун нитенпирамни миқдорий аниқлашда ишончли, тез ва амалий жиҳатдан самарали ускуна сифатида тавсия этилади.

Бундан кейинги тадқиқотлар нитенпирам ва унинг метаболитларини биологик матрицалар (қон, сийдик, жигар тўқимаси) да ЮССХ-МС/МС ёрдамида аниқлаш ва AGREE экологик яшиллик мезонлари бўйича баҳолашга йўналтирилган бўлади.

Adabiyotlar, References, Литературы:

Matsuda K, Shimomura M, Ihara M, Aoki T, Nishiwaki H. Neonicotinoids show selective and diverse actions on their nicotinic receptor targets: electrophysiology, molecular biology, and receptor modeling studies. Biosci Biotechnol Biochem. 2005;69(8):1442–1452. doi:10.1271/bbb.69.1442

Nauen R, Denholm I. Resistance of insect pests to neonicotinoid insecticides: current status and future prospects. Arch Insect Biochem Physiol. 2005;58(4):200–215. doi:10.1002/arch.20043

Dobson RL, Zinkl JG, Moriello KA, Lacy MD, Foil LD. Summary of the efficacy of nitenpyram against fleas on cats and dogs. Vet Parasitol. 2000;89(4):295–303. doi:10.1016/S0304-4017(99)00247-X

Shibata T, Ogawa K, Torii Y, Yasui H, Maekawa K. Pharmacokinetics and metabolism of nitenpyram in dogs and cats after a single oral dose. J Vet Pharmacol Ther. 1992;15(4):355–361.

Nishi K, Hundal SS. Nitenpyram: its metabolic fate in mammals and the environment. J Agric Food Chem. 2013;61(11):2610–2618. doi:10.1021/jf305101x

Morrissey CA, Mineau P, Devries JH, Sanchez-Bayo F, Liess M, Cavallaro MC, Liber K. Neonicotinoid contamination of global surface waters and associated risk to aquatic invertebrates: a review. Environ Int. 2015;74:291–303. doi:10.1016/j.envint.2014.10.024

Khabibullaev, S., Yuldashev, N., & Mamazulunov, N. (2023). Metabolic changes in the body as the result of long-term use of artificial sweetener-sodium cyclamate. Science and innovation, 2(D10), 64-70..

Қодиров, Р. Ш., Мамазулунов, Н. Х., Ботиров, Э. Х., & Юсупов, М. М. (2020). Флавоноиды russowia sogdiana (BGE). fedsch. Экономика и социум, (12-1), 628-631.Swamy N, Priyanka M, Naidu GP. A validated RP-HPLC method for the simultaneous estimation of flea treatment compounds in veterinary tablets. J Pharm Sci Res. 2016;8(7):698–703.

Zhang Y, Zhang L, Shi H, Hua X, Cao Y, Chen J. Determination of nitenpyram and its metabolite N-desmethyl nitenpyram in dog plasma by UHPLC-MS/MS. J Pharm Biomed Anal. 2018;159:441–447. doi:10.1016/j.jpba.2018.07.010

Hou X, Sun H. Capillary electrophoresis with amperometric detection for the simultaneous determination of neonicotinoid insecticides. Electrophoresis. 2008;29(18):3785–3792. doi:10.1002/elps.200800108

Мамазулунов, Н. (2021). Послеоперационные острые эрозии и язвы и их клинико-биохимичесий прогноз. Экономика и социум, (3-2 (82)), 116-119.

Nurmuhammad, M. (2025). Buyraklarda urat toshlari hosil bo ‘lishi va davolash yo ‘llari. Ta'lim innovatsiyasi va integratsiyasi, 59(3), 90-94.

Mamazulunov, N. (2021). Inorganic phosphate and principles of fluorescence. Экономика и социум, (3-1 (82)), 167-169.Snyder LR, Kirkland JJ, Dolan JW. Introduction to Modern Liquid Chromatography. 3rd ed. Hoboken, NJ: Wiley; 2010. p. 143–198.

Shah VP, Midha KK, Dighe S, McGilveray IJ, Skelly JP, Yacobi A, Layloff T, Viswanathan CT, Cook CE, McDowall RD, Pittman KA, Spector S. Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies. Pharm Res. 1992;9(4):588–592. doi:10.1023/A:1015829422034

Youden WJ, Steiner EH. Statistical Manual of the AOAC. Washington, DC: Association of Official Analytical Chemists; 1975.

Agilent Technologies. Agilent Zorbax SB-C18 Column Care and Use Guide. Publication No. 5990-4803EN. Santa Clara, CA: Agilent; 2022.

British Pharmacopoeia 2024. Volume V: Veterinary. London: The Stationery Office; 2024.

Pena-Pereira F, Wojnowski W, Tobiszewski M. AGREE: Analytical GREEnness metric approach and software. Anal Chem. 2020;92(14):10076–10082. doi:10.1021/acs.analchem.0c01887